Sawisé 25 dina inkubasi statis ing suhu 28°C, lakase saka *Pleurotus ostreatus* NRC620 nuduhaké aktivitas paling dhuwur ing medium kultur jamur. Nilai pH lan suhu optimal kanggo enzim iki yaiku 3,0 lan 70°C. Sawisé 2 jam inkubasi ing suhu 40°C lan 50°C, aktivitas enzim tetep ana 68,33% lan 59,61%. Sawisé 2 jam inkubasi ing buffer sitrat-fosfat (pH 7,0), aktivitas enzim tetep ana ing 100%. Penambahan 10 mM MgSO₄ lan CuSO₄ nambah aktivitas enzim kira-kira 21% lan 35%, déné NaCl, MnCl₂, KCl, lan CaCl₂ nyegah aktivitas enzim. Nggunakake ABTS minangka substrat, parameter kinetik (Km lan Vmax) saka *Pleurotus ostreatus* NRC 620 laccase yaiku 1,99 mM lan 16.217 μmol min−1 L−1. Perawatan enzimatik sampel jus apel nyuda pH lan viskositas kanthi signifikan, lan pengurangan iki ana hubungane karo peningkatan wektu panyimpenan. Perawatan laccase nyebabake penurunan tipis ing total kandungan fenolik jus apel, nanging ora ana penurunan aktivitas antioksidan sing diamati.
Ing taun-taun pungkasan, para peneliti wis fokus ing aplikasi bioteknologi ijo ing industri panganan. Laccase minangka salah sawijining enzim sing paling migunani ing industri panganan, nemokake aplikasi ing bidang kayata pangolahan jus, baking, stabilisasi anggur, lan ningkatake kualitas organoleptik produk panganan.1Akeh tanduran tingkat dhuwur lan mikroorganisme sing ngetokake laktase,2lan jamur kaya ta deuteromycetes, ascomycetes, lan basidiomycetes uga bisa ngasilake laccase.3Lakcase (EC 1.10.3.2) iku oksidase biru sing ngurangi oksigen molekuler dadi banyu nggunakake sistem sing kasusun saka telung atom tembaga sing beda, saengga ngoksidasi macem-macem senyawa fenolik lan amina aromatik. Sajrone produksi jus woh lan sayuran, pencoklatan enzimatik lan nonenzimatik minangka masalah kritis.4Amarga zat-zat kasebut nduweni pengaruh negatif marang warna, rasa, lan aroma jus, mula zat-zat kasebut kudu disingkirake.5
Saka kabeh woh-wohan, apel minangka sing paling akeh dikonsumsi ing saindenging jagad lan ing Uni Eropa. Ing taun 2019, produksi apel ana ing peringkat katelu ing donya, ngluwihi 87 yuta ton.6Apel ngandhut akèh senyawa fenolik, kalebu flavonoid lan asam fenolik kaya ta asam kafein lan asam klorogenat.7Amarga jus apel biasane dikonsumsi ing wujud sing bening, kira-kira 50% nganti 90% komponen fenolik ilang sajrone proses filtrasi.8Saiki, konsumen cenderung milih produk sing ora diproses kanthi akeh, kayata jus apel keruh kanthi kandungan polifenol sing dhuwur. Nanging, amarga kandungan fenolik sing dhuwur, jus apel jinis iki rentan banget kanggo owah warna lan dadi peteng.9Maneka warna teknologi, kalebu metode perawatan panas kayata pasteurisasi ing suhu 60–90°C, digunakake kanggo ngurangi utawa nyegah petenging jus apel.10Nanging, miturut riset dening Sauceda-Gálvez11, pangolahan termal bisa ngrusak bahan kimia sing gampang nguap lan mengaruhi kualitas organoleptik jus apel. Alternatif kanggo metode pangolahan termal kalebu karbon dioksida superkritis, radiasi ultraviolet, ultrasonik, tekanan hidrostatik dhuwur, utawa homogenisasi tekanan dhuwur.12Efisiensi teknologi kasebut lan asil jus woh sing cocog gumantung saka parameter sing digunakake lan karakteristik produk. Panggunaan sing nyebar diwatesi dening biaya sing dhuwur, efek negatif marang kualitas sawetara produk panganan, utawa inaktivasi enzim sing ora cukup.13,14
Laccase bisa digunakake kanggo nyetabilake lan njlentrehake jus woh.15Gökmen lan liya-liyane.16nyaranake panggunaan laccase kanggo klarifikasi jus woh amarga efektif mbusak senyawa fenolik kanthi ngowahi dadi polimer utawa oligomer sing gampang dicopot dening membran ultrafiltrasi apa wae, saengga jus apel bisa njaga warna lan kejelasan sing stabil nganti nem minggu ing suhu 50°C. Laccase *Trichoderma* sing wis dimurnèkaké diimobilisasi ing manik-manik alumina lan digunakake kanggo mbusak senyawa rasa sing ora enak sing disebabake dening kontaminasi mikroba jus apel kanthi selektif.17
Kira-kira 80-90% komponen volatil jus apel yaiku ester lan aldehida, sing menehi aroma unik marang jus kasebut.18Lakcase saka *Trametes versicolor* diimobilisasi ing dhukungan murah sing digawe saka serat alami saka batok klapa enom kanggo njlentrehake jus apel.19Panliten sadurungé wis nyelidiki stabilisasi jus apel (werna lan kekeruhan) nggunakaké metode bebas enzim utawa imobilisasi, utawa dikombinasikaké karo ultrafiltrasi.5,19Nanging, efek saka laksa jamur marang sifat fisikokimia jus apel sajrone panyimpenan isih durung jelas. Mulane, tujuan saka panliten iki yaiku kanggo nyelidiki kanthi eksperimen owah-owahan ing sifat fisikokimia, kandungan senyawa fenolik, lan aktivitas antioksidan jus apel sawise perawatan nganggo laksa jamur lan panyimpenan rong minggu ing kulkas. Laksa nduweni kemampuan kanggo ngoksidasi senyawa fenolik, sing ndadekake dheweke janjeni kanggo digunakake ing macem-macem proses industri, kalebu klarifikasi jus. Panliten iki nliti laksa saka *Pleurotus ostreatus* NRC 620, kanthi fokus ing kahanan sing ideal kanggo aktivitas lan efektifitas ing klarifikasi jus. Nalika riset babagan jamur tiram (P. ostreatus NRC 620) isih winates, panliten sadurunge wis nliti enzim saka macem-macem sumber jamur, kayata Trametes versicolor lan Ganoderma lucidum. Tujuan saka panliten iki yaiku kanggo ngevaluasi potensial aplikasi enzim iki ing industri panganan lan nyorot sifat unik, utamane pH lan suhu sing ideal.
2,2′-Azooxybis (3-etilbenzotiazolin-6-asam sulfonat) (ABTS) dituku saka Sigma-Aldrich (Kanada). Kabeh reagen liyane duwe kelas analitis.
Pusat Koleksi Kultur Mikroba Pusat Riset Nasional entuk galur jamur tiram sing dikenal NRC620. Sawise subkultur, galur iki disimpen ing agar dekstrosa kentang ing suhu 4°C. Cara persiapan inokulum kaya ing ngisor iki: Miselium umur 10 dina sing wis berkembang kanthi lengkap diinokulasi ing piring agar dekstrosa kentang lan diinkubasi ing suhu 28°C. Sawise 10 dina, telung blok miselium diameter 12 mm dicopot saka media agar nggunakake pelubang logam steril lan dilebokake ing labu Erlenmeyer 250 mL nganggo sumbat kapas sing ngemot 50 mL medium kultur sing wis disterilisasi (pH 5.0, kaya sing diterangake sadurunge dening Othman et al.20). Kultur kasebut diinkubasi ing suhu 28°C sajrone 18 dina. Kultur kasebut banjur disaring nganggo kertas saring Whatman No. 1, lan supernatan sing diasilake dadi sumber enzim.
Aktivitas lakcase ditemtokake nggunakake ABTS minangka substrat. Campuran reaksi (2 mL) ngandhut 500 μL 0,3 mM ABTS (dilarutake ing buffer natrium sitrat 0,1 M, pH 4,5) lan jumlah sampel enzim sing dibutuhake sing diencerake nganggo banyu suling.21,22Ngelingi yen laccase bisa ngoksidasi ABTS ing suhu kamar (28 °C ± 2), oksidasi ABTS ditemtokake kanthi ngukur paningkatan absorbansi ing 420 nm (ε420= 36.000 cm-1 M -1) nggunakake spektrofotometer UV Agilent Carry-100. Siji unit aktivitas laccase dibutuhake kanggo ngoksidasi 1 μmol ABTS saben menit. Konsentrasi protein ditemtokake kanthi metode Bradford nggunakake albumin serum sapi minangka kontrol internal.23,24
Sawisé éntuk enzim saka galur jamur tiram NRC 620, aktivitasé diukur ing interval budidaya sing béda-béda sajrone 25 dina ing kondisi statis ing suhu 28 °C.
Kanggo nyinaoni efek suhu marang aktivitas laccase, eksperimen ditindakake ing kisaran suhu saka 20 nganti 90 °C. Sadurunge nambahake enzim lan miwiti reaksi, buffer (0,1 M natrium sitrat, pH 4,5) lan substrat (ABTS) dicampur lan diinkubasi sajrone 5 menit ing macem-macem suhu. Stabilitas termal enzim ditaksir kanthi inkubasi ing buffer natrium fosfat 0,05 M (pH 7,0) ing suhu 40, 50, 60, lan 70 °C sajrone 2 jam. Aktivitas residu banjur ditaksir nggunakake substrat ABTS.
Efek pH marang aktivitas laccase ditaksir nggunakake ABTS minangka substrat ing buffer sitrat-fosfat 0,1 M kanthi kisaran pH 2,5 nganti 7,0. Larutan enzim diinkubasi ing suhu 40°C sajrone rong jam ing buffer sitrat lan Tris 0,1 M (pH 3, 4, 6, lan 7) kanggo neliti stabilitas pH. Aktivitas residual karo ABTS minangka substrat diitung sawise inkubasi.
Lakase diinkubasi sajrone 10 menit ing buffer natrium fosfat (0,05 M, pH 7,0) sing ngemot macem-macem ion logam (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+, lan Mn2+) kanthi konsentrasi 2,5 mM lan 10 mM. Substrat (ABTS) banjur ditambahake kanggo miwiti reaksi, lan aktivitas relatif ditaksir.
Oksidasi ABTS déning laccase ing macem-macem konsentrasi (0,025–3 mM) diukur ing pH 4,5 kanggo nemtokaké parameter kinetik (Vmax lan Km). Kinetikkonstantasaka persamaan Michaelis-Menten diitung nggunakake plot Lineweaver-Burk, sing nggambar kebalikan saka laju reaksi minangka fungsi konsentrasi substrat. Konstanta kinetik diitung saka plot Lineweaver-Burk nggunakake piranti lunak GraphPad Prism versi 6.01.
Sawisé apel dikumbah nganggo banyu ledeng kanthi resik, apel-apel mau dibelah dadi loro lan dijus nganggo juicer apel Braun MP80 otomatis (digawé ing Jerman). Jus kasebut disaring nganggo patang lapis kain kasa. Ora ana enzim sing ditambahake ing klompok kontrol, dene 2,0% laccase (konsentrasi paling efektif sing diuji) ditambahake ing jus apel sing nembe disiapake, sing banjur disimpen ing suhu 4°C sajrone rong minggu.
Asam sing bisa dititrat (TA) lan pH ditemtokake miturut metode Boulton et al.al.27pH saben sampel diukur nganggo meter pH digital (JENWAY 3510 pH meter). Keasaman sing bisa dititrasi (TA) diitung adhedhasar asam malat nganggo rumus ing ngisor iki.
Ing ngendi V lan C minangka volume (mL) lan konsentrasi (0,1 mol/L) saka larutan natrium hidroksida sing digunakake ing titrasi. K minangka koefisien konversi asam malat, padha karo 0,067, lan W minangka massa (g) jus apel.
Total padatan larut (TDS (Tempat Kerja)) isi kabeh sampel jus ditemtokake nggunakake refraktometer saku PAL-1 (ATAGO, Tokyo, Jepang). Sawise saben pangukuran, lensa optik dibilas nganggo banyu deionisasi, lan saben sampel jus apel diuji kaping telu. Nilai kanggo saben sampel diitung kanthi rata-rata telung pangukuran kasebut. Rata-rata ± deviasi standar kanggo saben sampel jus apel uga diitung kanthi rata-rata asil kasebut.
Viskoelastisitas sampel jus apel ditaksir nggunakake viskometer rotasi (RV, Rheotest 2, Jerman). Sampel kasebut dilebokake ing njero silinder "S2" viskometer. Viskositas katon diwakili dening kemiringan kurva tegangan geser lawan laju geser, sing diitung saka tegangan geser lan kurva sing cocog ing macem-macem laju geser (saka 1,00 nganti 437,4 s⁻¹). Rumus kanggo ngetung viskositas katon kaya ing ngisor iki:
Ing ngendi η minangka viskositas katon (cP), τ minangka tegangan geser (dyn/cm²), γ minangka laju geser (sec⁻¹), lan (τ) diitung nggunakake nilai torsi (α) lan silinder (Z) nggunakake rumus ing ngisor iki: τ = Z. α.
Indeks pencoklatan ditemtokake miturut metode Meidav etal.29Sampel jus 10 ml disentrifugasi ing 2750 xg sajrone 10 menit. 5 ml supernatan jus dicampur karo 5 ml etanol 95%. Absorbansi campuran kasebut diukur ing 420 nm nggunakake spektrofotometer UV Shimadzu (UV-1601 PC).
Kandungan fenolik total (TPC) ditemtokake kanthi kolorimetri nggunakake reagen Folin-Ciocalteu kaya sing diterangake dening Boulton et al.[27]Kurva standar asam galat digawe kanggo konsentrasi saka 0 nganti 500 mg/L (r²= 0.997). Asil kasebut ditulis minangka padanan asam galat (mg GAE/mL).
Tambahna 125 μL banyu suling lan 2850 μL larutan FRAP menyang 25 μL jus apel lan tinggalna campuran kasebut ing panggonan sing peteng sajrone30menit. Banjur ukur absorbansi ing 593 nm nggunakake spektrofotometer UV Shimadzu (UV-1601 PC). Reagen FRAP disiapake kanthi nyampur 300 mM buffer asetat (pH 3.6), 20 mM wesi (III) klorida, lan 10 mM 2,4,6-tris (2-piridil)triazin (TPTZ) (dilarutake ing 40 mM HCl) kanthi rasio 10:1:1. Kurva standar digawe nggunakake Trolox minangka standar (R²= 0.999), lan asilé ditulis minangka μM Trolox/mL.
Aktivitas antioksidan saka jus sing diolah lan ora diolah ditemtokake nggunakake metode DPPH kanggo ngevaluasi kemampuane kanggo nahan radikal bebas DPPH.31Sepuluh mikroliter jus dicampur karo 1 ml larutan DPPH (100 μM) ing metanol. Sawise reaksi ing peteng sajrone 30 menit, absorbansi campuran kasebut diukur ing 517 nm nggunakake spektrofotometer UV Shimadzu (UV-1601 PC). Asil kasebut dinyatakake minangka ekivalen trolox (μM trolox/ml) adhedhasar kurva kalibrasi (R2= 0.990).
Data sing dipikolehi nuduhake yen produksi lakase maksimal diamati ing jamur tiram NRC 620 ing pungkasan dina kaping 18 fermentasi, tekan aktivitas 1302 U/L. Iki dadi dhasar kanggo nemtokake wektu budidaya optimal kanggo produksi lakase (Gambar 1). Sanajan produksi enzim mundhak kanthi nambah wektu budidaya, tingkat kenaikan ora proporsional langsung karo wektu budidaya; sawise 21 dina, aktivitas enzim mung mundhak 90 U/L (nganti 1390 U/L). Mulane, 18 dina pungkasane dipilih minangka wektu budidaya optimal kanggo ngimbangi asil produk karo keuntungan ekonomi saka tambah wektu budidaya.
Efek wektu budidaya marang asil laccase ing Pleurotus ostreatus NRC 620. Telung blok miselium jamur (12 mm) diinokulasi menyang 50 ml medium steril banjur dikultur ing suhu 28 °C kanggo wektu sing beda-beda.
Konsisten karo panliten liyane, asil panaliten nuduhake yen periode kultur sing ideal kanggo entuk puncak sekresi lakase dening jamur yaiku antarane 7 lan 36 dina.32Miturut Ezike et al.33, *Trametes polyzona* WRF03 ngasilake jumlah lakase paling dhuwur ing pungkasan dina kaping sanga fermentasi, kanthi aktivitas spesifik protein 1637 U/mg. Salajengipun, Othman et al.34nemokake yen *Trichoderma harzianum* S7113 ngetokake akeh laktase ing dina kaping lima budidaya. Tingkat produksi laktase tekan aktivitas puncak ing dina kaping patbelas lan banjur mudhun kanthi bertahap.34Senajan sekresi enzim uga bisa kedadeyan sajrone fase pertumbuhan utama, biasane puncaknya sajrone fase menengah lan dipicu dening konsumsi sumber karbon utawa nitrogen.34,35
Senajan laccase saka Pleurotus ostreatus NRC 620 nuduhake aktivitas sing dhuwur ing kisaran suhu sing amba saka 50°C nganti 80°C, nyedhaki aktivitas puncak (69–98%), aktivitas maksimal diamati ing 70°C (Gambar 2a). Ing njaba kisaran suhu iki, aktivitas enzim mudhun ing kira-kira 70°C. Asil kasebut nuduhake yen enzim aktif ing suhu dhuwur, kemungkinan amarga suhu dhuwur nambah energi kinetik reaksi kasebut.
Efek suhu reaksi (a) lan pH (b) marang aktivitas laccase ing *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Suhu wiwit 20 nganti 90 °C digayuh kanthi nginkubasi campuran kasebut ing suhu sing beda-beda sajrone 5 menit sadurunge nambahake enzim lan miwiti reaksi. Efek pH marang aktivitas laccase ditaksir nggunakake ABTS minangka substrat ing larutan sing ngemot 0,1 M buffer sitrat-fosfat ing kisaran pH 2,5 nganti 7,0.
Miturut Ezike et al.al.33, suhu optimal kanggo *Trametes polyzona* WRF03 laccase yaiku 55 °C, sing padha karo kanggo *Ganoderma lucidum*laccase36lan padha karo suhu optimal (50 °C) kanggo *Trametes polyzona* KU-RNW02737laccase . Baldrian38nyathet yen, kaya sistem enzim pendegradasi lignin liyane, kisaran suhu sing ideal kanggo laccase yaiku antarane 50 lan 70 °C.
Asil panliten nuduhake yen enzim kasebut nduweni aktivitas paling dhuwur ing pH 3.0, tekan aktivitas 94% ing pH 3.5. Nanging, tetep aktif ing kisaran pH sing amba saka 2.5 nganti 7.0 (Gambar 2b). Salajengipun, nduweni aktivitas sing luwih dhuwur ing kahanan asam dibandhingake karo kahanan netral utawa basa. Aktivitas kasebut tetep paling ora 77% ing kisaran pH saka 2.5 nganti 4.5, nanging mung tekan kira-kira 38% ing pH 7.0. pH optimal kanggo laccase saka *Trametes polyzona* WRF03 yaiku 4.533, sing padha karo pH kanggo laccase saka *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40, lan *Trametes hirsuta* 41. Nanging, miturut panliten dening Chairin et al.42, pH optimal kanggo laccase saka *Polymorpha f. sp.* WR710-1 yaiku 2,2, dene pH optimal kanggo laccase saka *Polymorpha f. sp.* IBL-04 yaiku 5,043. Ikatan anion hidroksida (inhibitor laccase) menyang atom tembaga laccase T2/T3 bisa dadi alesan kanggo penurunan aktivitas laccase ing kahanan pH netral utawa alkali. Iki bisa ngganggu transfer elektron internal saka pusat T1 menyang pusat T2/T3, saenggambatesiaktivitas enzim 23,44
Kanthi nginkubasi enzim ing suhu sing beda-beda, ditemokake manawa wektu inkubasi lan suhu mengaruhi stabilitas enzim. Khususé, laccase saka *Trametes polyzona* NRC 620 nuduhake stabilitas sing luwih dhuwur ing 40℃ lan 50℃, nahan 68,33% lan 59,61% saka aktivitas awal, sawise 120 menit (Gambar 3a). Kosok baline, ing kahanan sing padha (40℃ lan 50℃, 120 menit), laccase saka *Trametes polyzona* WRF03 nahan 64,38% lan 42,92% saka aktivitase, masing-masing.33Kosok baline, tambahing wektu lan suhu inkubasi nyuda stabilitas *Trametes polyzona* NRC 620 laccase; Sawise inkubasi ing suhu 60℃ lan 70℃ sajrone 60 menit, aktivitase mudhun dadi 39,24% lan 1,72% (Gambar 3a). Konsisten karo asil eksperimen, laccase saka *Trametes polyzona* WRF03 nuduhake stabilitas sing luwih dhuwur ing suhu 40 lan 50℃ sajrone proses perawatan termal.33Semono uga, Lueangjaroenkit lan liya-liyaneal.37lan Chairin lan liya-liyaneal.42nglaporake stabilitas laccase saka Trametes polyzona KURNW027 lan Trametes polyzona WR710-1 ing suhu 50 °C sajrone 1 jam. Minangka biokatalis sing migunani sing bisa ditrapake ing macem-macem bidang bioteknologi, laccase kudune duwe stabilitas lan kinerja sing apik ing kisaran suhu sing amba.
Stabilitas termostatik (a) lan stabilitas pH (b) saka laccase saka *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Stabilitas termostatik ditaksir kanthi nginkubasi larutan enzim ing buffer natrium fosfat 0,05 M (pH 7,0) ing suhu 40, 50, 60, lan 70 °C sajrone 2 jam. Stabilitas pH ditaksir kanthi nginkubasi larutan enzim ing buffer sitrat 0,1 M lan buffer Tris (pH 3, 4, 6, lan 7) ing suhu 40 °C sajrone 2 jam. Aktivitas residu diitung nggunakake ABTS minangka substrat sawise inkubasi.
Kanggo nemtokake kahanan optimal kanggo panggunaan lan panyimpenan enzim, kita nyelidiki efek pH marang stabilitas laccase. Paparan nilai pH sing beda-beda nduweni pengaruh sing signifikan marang stabilitas struktur protein, saengga mengaruhi stabilitas lan aktivitas molekul enzim. Asil kasebut nuduhake yen enzim kurang stabil ing kahanan asam, dene nuduhake stabilitas sing luwih apik ing nilai pH sing luwih dhuwur (wilayah netral lan alkali). Ing nilai pH 7,0, 6,0, 4,0, lan 3,0, tingkat retensi enzim sawise 120 menit kira-kira 100%, 62,54%, 52,39%, lan 11,14% (Gambar 3b). *Strombus multisus* WRF03 laccase nuduhake stabilitas sing luwih dhuwur ing nilai pH netral (5,5–6,5) lan stabilitas sing luwih murah ing nilai pH asam (ing ngisor 4,0). Sawisé 120 menit ing nilai pH 5,5, 6,0, lan 6,5, tingkat retensi enzim kira-kira 82%, 100%, lan 93%.33Khairin lan liya-liyane.42nyathet yen laccase saka Trametes polyzona WR710-1 stabil ing kisaran pH 6,0 nganti 7,0, dene Sayed et al.45nuduhake yen laccase luwih stabil ing kahanan pH netral. Nanging, laccase saka Cerrena unicolor uga nuduhake stabilitas ing kahanan alkali (pH 9.0)46Lakase sing ditliti nuduhake stabilitas sing dhuwur ing kisaran pH sing amba. Iki bisa uga dadi ciri penting kanggo aplikasi industri.
Amarga sawetara ion logam nduweni efek stimulasi lan inhibisi marang aktivitas enzim, efek kasebut marang aktivitas enzim kudu ditimbang ing aplikasi industri. Iki penting banget amarga ion logam minangka kontaminan lingkungan umum sing bisa mengaruhi stabilitas lan sintesis enzim ekstraseluler.47Kanggo nyelidiki efek saka pirang-pirang ion logam ing laccase saka *Pleurotus ostreatus* NRC 620, kita nganakake eksperimen sing cocog. Kaya sing dituduhake ing Gambar 4, gumantung saka jinis logam sing digunakake, nambah konsentrasi ion logam saka 2,5 mM dadi 10 mM nduweni pengaruh negatif marang fungsi enzim. Contone,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺, lanCu²⁺bisa ngrangsang lan ngaktifake aktivitas enzim, deneNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺, lanK⁺bisa nyegah aktivitas enzim. Ing konsentrasi 10 mM, ion Cu²⁺ lan Mg²⁺ minangka aktivator aktivitas lakase sing paling kuat saka *Pleurotus ostreatus* NRC 620, sing nyedhiyakake derajat aktivasi kira-kira 34% lan 20%. Nanging, ing konsentrasi 10 mM, ion Ca²⁺ minangka inhibitor lakase sing paling kuat, sing nyuda aktivitas enzim kira-kira 60%.
Efek ion logam marang aktivitas Pleurotus ostreatus NRC 620 laccase. Laccase diinkubasi sajrone 10 menit ing buffer natrium fosfat (0,05 M, pH 7,0) sing ngemot macem-macem ion logam kanthi konsentrasi 2,5 mM lan 10 mM. Reaksi kasebut banjur diwiwiti kanthi tambahan substrat (ABTS), sawise iku aktivitas relatif diukur.
Asil panliten iki konsisten karo asil panliten saka penulis liyane sing nemokake yen Mg²⁺ lan Cu²⁺ ningkatake aktivitas *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño et al.⁴⁸ nemokake yen laccase saka *Xylaria* sp. dirangsang nganti sawetara tingkat dening ion tembaga (Cu²⁺). Salajengipun, Foroutanfar et al.⁴⁹ lan Si et al.⁵⁰ nindakake panliten sing padha babagan laccase saka *Paraconiothyrium variabile* lan *Trametes pubescens*. Situs pengikat tembaga tipe II (T2) saka enzim iki bisa jenuh karo Cu²⁺ ing konsentrasi tartamtu, sing bisa nerangake stimulasi aktivitas laccase ing konsentrasi Cu²⁺³⁹ sing luwih dhuwur. Amarga lakase jamur bosok putih minangka oksidase sing ngemot pirang-pirang atom tembaga, efek ion tembaga ing aktivitas lakase maneka warna lan wiwit saka stimulasi lan inhibitor nganti netral.⁵¹ Kosok baline, Zhou et al.[52]nglaporake yenCu²⁺nyegah aktivitas laccase rayap bawah tanah Taiwan (Odontotermes formosanus). Nanging, laccase saka Cerena sp. HYB07[53]lan Clitocybe maxima[54]ora kena pengaruh ion tembaga.
Spesifisitas substrat diwakili dening parameter kinetik (Km lan Vmax); luwih kuwat afinitas pengikatan substrat marang enzim, luwih endhek nilai Km lan luwih dhuwur spesifisitas substrat.3,21,55Parameter kinetik (Km lan Vmax) saka laccase saka *Pleurotus ostreatus* NRC 620 ditemtokake nggunakake piranti lunak GraphPad Prism 6.0 kanthi nggambar plot Lineweaver-Burk (Gambar 5). Nalika nggunakake ABTS minangka substrat, asil sing dipikolehi yaiku 1,99 mM lan 16217 μmolmin⁻¹ L⁻¹,mungguh-mungguh. Elsayed et al.21nglaporake yen nilai Km kanggo oksidasi ABTS yaiku 0,1 mM lan 0,064 mM, masing-masing, nuduhake afinitas dhuwur saka isoenzim Lac A lan Lac B kanggo ABTS. Salajengipun, nilai Vmax yaiku 0,182 μmolmin⁻¹lan 0,603 μmolmin⁻¹, mungguh-mungguh. Nilai Km sing dipikolehi luwih murah tinimbang Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); salajengipun, nilai Vmax (1429 mmol min⁻¹) ugaluwih endheknalika nggunakake ABTS minangka substrat.33 Kajaba iku, nilai Km saka konsentrasi laccase Lentinus squarrosulus MR13 lan Trametes sp. AH28-2 yaiku 0,0714 mM lan 0,025 mM, lan nilai Vmax yaiku 0,0091 mM min−1 lan 0,67 mM min−1 mg−1 (relatif karo ABTS), mungguh-mungguh.56,57
Efek konsentrasi ABTS marang aktivitas laccase saka *Pleurotus ostreatus* NRC 620 diselidiki, lan plot Lineweaver-Burk saka timbal balik kecepatan reaksi awal lawan konsentrasi ABTS diplot. Reaksi oksidasi ABTS kanthi konsentrasi sing beda (0,025–3,0 mM) saka laccase diukur ing pH 4,5 kanggo nemtokake parameter kinetik (Vmax lan Km). Konstanta kinetik Michaelis-Menten diitung nggunakake plot Lineweaver-Burk saka timbal balik kecepatan reaksi lawan konsentrasi substrat. Konstanta kinetik diitung saka plot Lineweaver-Burk nggunakake piranti lunak GraphPad Prism 6.01.
Enzim klarifikasi tradisional, kayata pektinase, nghidrolisis zat pektik, ngurangi viskositas lan kekeruhan. Enzim iki kanthi efektif ngrusak polisakarida struktural lan asring digunakake bebarengan karo enzim liyane, kayata selulase lan hemiselulase, kanggo nambah asil lan kejernihan. Nanging, pektinase ora khusus nargetake senyawa fenolik, sing dadi kontributor utama kekeruhan lan pencoklatan oksidatif, utamane ing jus kayata jus apel lan anggur.58Kosok baline, laccase ngkatalisis oksidasi senyawa fenolik, polimerisasi dadi molekul sing luwih gedhe lan ora larut sing bisa diilangi kanthi sedimentasi utawa filtrasi. Mekanisme iki ora mung nambah kejernihan nanging uga ngluwihi umur simpan jus kanthi nyuda kemungkinan browning oksidatif sing disebabake dening senyawa fenolik. Salajengipun, proses klarifikasi adhedhasar laccase bisa ditindakake ing kahanan pangolahan sing entheng (pH 3,5–5,5, suhu 25–40 °C), saengga cocog kanggo jus sing alus tanpa ngorbanake sifat nutrisi utawa organoleptik.59Panliten nuduhake yen perawatan pektinase bisa njlentrehake jus sajrone 1-2 jam, dene perawatan laccase biasane mbutuhake wektu reaksi sing luwih suwe (3-6 jam) kanggo nyuda senyawa fenolik kanthi lengkap. Nanging, proses iki bisa dioptimalake kanthi ngimobilisasi enzim utawa kanthi nggabungake laccase karo metode klarifikasi mekanik.60Ing panliten iki, profil enzim saka ekstrak mentah nuduhake aktivitas lakase lan α-amilase sing signifikan, dene aktivitas pektinase lan xilanase sithik banget, lan aktivitas selulase ora dideteksi. Mulane, penurunan kekeruhan lan kandungan fenolik utamane amarga aksi lakase, dene owah-owahan viskositas bisa uga sebagian amarga aksi amilase.
Tabel 1 nuduhake parameter fisikokimia jus apel sing nembe diperes lan sampel sing diolah nganggo laktase. Asil kasebut nuduhake yen asil jus apel sing nembe diperes (71,59%) luwih murah tinimbang sampel sing diolah nganggo laktase (87,34%). Asil kasebut cocog karo temuan Pilnik lan Orange.61, sing nuduhake yen panggunaan enzim ing pangolahan woh-wohan bisa nambah asil jus, ningkatake filtrasi, lan entuk jus sing bening lan berkualitas tinggi kanggo konsentrasi. Peningkatan asil jus utamane amarga tambah akeh kandungan gula sing larut ing jus kasebut. Sajrone hidrolisis enzimatik woh-wohan, mesoglea lan pektin ing dinding sel produk kasebut dirusak lan diowahi dadi zat sing larut kayata gula netral lan asam.62.Nilai pH jus apel sing diwenehi enzim luwih murah tinimbang klompok kontrol (P < 0,05), lan nilai pH kaloro klompok kasebut mundhak sacara signifikan sajrone panyimpenan (Tabel 1). Asil kasebut konsisten karo asil saka Mark et al.63, sing nyathet yen pH jus woh mete mudhun sawise disimpen sawise perawatan panas. Degradasi pektin lan pembentukan asam galakturonat sawise perawatan enzim bisa uga dadi penyebab kenaikan pH sajrone panyimpenan. pH sampel sing diolah enzim tetep ana ing antarane 4,05 lan 4,31 sajrone panyimpenan, dene pH jus apel sing ora diolah ana ing antarane 4,12 lan 4,33.
Total keasaman (TA) saka sampel sing ora diobati lan sing ora diobati nuduhake tren mudhun kanthi tambahing wektu panyimpenan (Tabel 1). Penurunan keasaman kasebut disebabake dening konversi asam organik dadi karbohidrat utawa reaksi enzimatik, uga oksidasi sajrone panyimpenan jus.64Total keasaman jus apel kontrol lan sampel sing diolah enzim luwih endhek tinimbang jus liyane (jus stroberi 0,9%, jus prem 2,2%, jus kumquat 1,0%, jus aprikot 2,4%, jus jeruk 0,8%), nanging padha karo jus liyane (kayata, jus pir 0,3%).62Bentenane jus apel sing nembe diperes sing ora diolah iki bisa uga disebabake dening macem-macem faktor kayata kondisi pertumbuhan, faktor genetik, tingkat kematangan, lan metode pangolahan.65Penurunan total keasaman jus apel kontrol lan sing diolah laccase konsisten karo asil sing diwenehake dening Singh et al.66babagan penurunan total keasaman jus apel Jin Nuo sawise 74 dina panyimpenan. Ing sisih liya, Oshmiansky lan Wojdylo67ora nemokake owah-owahan sing signifikan ing kaasaman jus apel nalika nyinaoni efek metode klarifikasi tradisional.
Asil sing dituduhake ing Tabel 1 nuduhake yen nilai total padatan larut (TSS) jus apel sing diolah laccase luwih dhuwur tinimbang sampel sing ora diolah. Asil kasebut konsisten karo panliten sing diterbitake..68Salajengipun, Tabel 1 nuduhaken bilih nilai TSS saking kelompok jus apel kontrol inggih punika 9,58 ing titik wektu wiwitan lan dumugi 11,05 ing pungkasan periode panyimpenan. Nilai-nilai kasebut langkung endhek tinimbang nilai TSS jus apel seger ingkang dipunlapuraken dening Hamid et al..69(11,2 lan 11,80). Nilai TSS saka sampel jus apel sing diolah laccase mundhak sacara signifikan, diwiwiti saka 11,23 lan tekan 12,93 sawise rong minggu disimpen ing suhu 4°C (Tabel 1). Peningkatan TSS sing padha sajrone panyimpenan uga diamati ing woh jeruk, lemon, lan jeruk manis. Peningkatan total padatan larut (TSS) sajrone panyimpenan bisa uga amarga hidrolisis polisakarida (pati) dadi monosakarida (gula), peningkatan konsentrasi amarga dehidrasi jus, lan degradasi pektin ing jus dadi padatan larut. Peningkatan total padatan larut (TSS) kemungkinan amarga peningkatan gula larut, sing bisa dibentuk dening konversi pektin utawa selulosa dadi gula larut dening pektin utawa selulase, utawa dening hidrolisis pati dadi gula, kaya sing dilapurake dening Hamed et al.69.Efek laccase marang sipat jus apel bisa diamati kanthi visual, amarga jus apel sing diolah laccase nuduhake aliran sing luwih apik lan viskositas sing luwih murah tinimbang jus sing ora diolah. Pengamatan iki kacathet ing Tabel 1; Viskositas sampel sing diolah enzim yaiku 1,87 cP, dene viskositas sampel kontrol yaiku 2,95 cP. Penurunan viskositas sing signifikan iki kemungkinan amarga kapasitas nahan banyu sing luwih dhuwur saka zat kaya pektin lan pembentukan struktur jaringan sing kohesif.
Ing panliten iki, efek laccase marang indeks browning (BI) jus apel diselidiki kanthi ngukur absorbansi ing 420 nm nggunakake spektrofotometer. Asil kasebut dituduhake ing Tabel 1. Sajrone panyimpenan, BI sampel jus apel ing klompok sing diobati lan ora diobati nuduhake tren sing saya tambah. BI nggambarake tingkat browning lan bisa dadising pentingindikator reaksi pencoklatan enzimatik lan non-enzimatik. Absorbansi mundhak sacara signifikan sajrone panyimpenan (P < 0,05). Ing pungkasan panyimpenan,A420Nilai sampel jus apel ing klompok kontrol lan klompok sing diobati enzim mundhak udakara 217% lan 121%, masing-masing (Tabel 1). Asil kasebut nuduhake yen perawatan enzim bisa kanthi efektif nyuda tingkat browning udakara 56%. Asil saka Bezerra et al.[19]] konsisten karo asil panaliten; Dheweke nggunakake serat lakase-glutaraldehida-klapa kanggo njlentrehake jus apel, saengga warna asline mudhun nganti 61%.
Senajan polifenol ing jus woh nduweni efek nutrisi lan terapeutik sing positif ing awak manungsa, polifenol uga bisa reaksi karo protein, nyebabake jus dadi keruh, sedimentasi, utawa kekeruhan, saengga ngganti rasa lan aroma produk kasebut lan nyuda umur simpan.71Tujuan saka panliten iki yaiku kanggo nyuda kandungan senyawa fenolik jus apel kanthi aman nggunakake laccase saka Pleurotus ostreatus NRC 620. Asil sing dituduhake ing Tabel 1 nuduhake yen total kandungan senyawa fenolik jus apel sing diolah laccase mudhun sacara signifikan sadurunge disimpen ing suhu 4 °C. Salajengipun, total kandungan senyawa fenolik uga mudhun sajrone panyimpenan ing loro sampel sing ditliti (Tabel 1). Riset dening Sandri et al.72nuduhake yen jus apel sing diolah nganggo enzim bisa njaga aktivitas antioksidan lan kandungan senyawa fenolik. Nanging, asil panliten dening Lettera et al.73nuduhake yen perawatan jus jeruk nganggo laktase jamur bisa nyuda kandungan senyawa fenolik ing njero nganti 45%.
Senyawa fenolik wis dituduhake nduweni sipat kaya ta ngresiki radikal bebas, reduksi lan pendinginan oksigen singlet, transfer atom hidrogen, lan sumbangan elektron marang radikal bebas, saengga dadi antioksidan sing kuat.74Mulane, ing panliten iki, metode berbasis DPPH lan FRAP digunakake kanggo ngevaluasi efek laccase marang aktivitas antioksidan jus apel sing disimpen ing kulkas sajrone 14 dina (Tabel 2). Kaloro metode kasebut nuduhake peningkatan aktivitas antioksidan sajrone panyimpenan, sing bisa uga amarga peningkatan senyawa fenolik bebas utawa pembentukan produk reaksi Maillard (MRP), kanthi produk reaksi Maillard sing bisa uga dadi panyebab peningkatan aktivitas antioksidan.75Reaksi pencoklatan non-enzimatik (kalebu degradasi asam askorbat, reaksi Maillard, lan degradasi gula sing dikatalisis asam) ngasilake pigmen coklat (melanoidin). Produk degradasi asam askorbat antara lan produk degradasi gula (kayata senyawa karbonil) bisa reaksi karo asam amino liwat reaksi Maillard.76Senajan warna coklat ing woh-wohan lan sayuran sajrone panyimpenan wis ditliti kanthi ekstensif, pangerten kita babagan reaksi kasebut isih winates.77Dibandhingake karo metode FRAP, jus apel sing diolah nganggo laccase nuduhake aktivitas antioksidan sing luwih murah kanthi metode DPPH (Tabel 2), lan aktivitas antioksidan saka kabeh sampel mundhak sacara signifikan kanthi nambah wektu panyimpenan. Rong metode sing beda kanggo nemtokake aktivitas antioksidan digunakake ing panliten iki amarga prinsip-prinsipe beda. Metode DPPH ngukur kemampuan kanggo netralake radikal bebas, dene metode FRAP ngukur kemampuan kanggo nyuda ion wesi. Mulane, disaranake nggunakake pirang-pirang metode kanggo nemtokake aktivitas antioksidan supaya luwih ngerti aktivitas antioksidan saka sampel sing ditliti.78
Salah sawijining temuan penting saka panliten iki yaiku *Pleurotus ostreatus* laccase NRC 620 nuduhake aktivitas optimal ing suhu 70°C lan pH 3.0. Dibandhingake karo laccase jamur liyane sing umum digunakake kanggo klarifikasi jus, kayata *Trametes versicolor* lan *Ganoderma lucidum* laccase, *P. ostreatus* NRC 620 nuduhake stabilitas termal sing luwih dhuwur lan pH sing luwih asam. Lakcase saka *Trametes versicolor* lan *Ganoderma lucidum* biasane nuduhake aktivitas optimal ing kisaran 50-60°C lan ing nilai pH antarane 3,5 lan 5,0. Bentenane iki bisa nyumbang kanggo efisiensi klarifikasi jus sing luwih apik, utamane kanggo jus asam ing ngendi stabilitas ing nilai pH sing luwih murah penting banget. Karakteristik unik *P. Dibandhingake karo laccase jamur liyane sing ditliti, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 nuduhake kemampuan kanggo berfungsi kanthi efektif ing kahanan sing luwih tantangan. Suhu aktivitas optimal sing luwih dhuwur nuduhake potensial kaluwihan ing aplikasi industri, kayata tingkat reaksi sing luwih cepet lan kontaminasi mikroba sing suda. pH sing endhek, sing cocog karo sifat asam saka akeh jus, bisa migunani ing proses klarifikasi jus. Asil kasebut mbenerake eksplorasi luwih lanjut kanggo aplikasi skala gedhe, nggawe *Pleurotus ostreatus* NRC 620 dadi alternatif sing bisa digunakake kanggo sumber laktase jamur tradisional. Dibandhingake karo panliten sadurunge, kita nemokake yen suhu optimal yaiku 60°C lan pH optimal yaiku 3.0. Sawise reaksi ing 60°C sajrone 80 menit, laktase *Ganoderma lucidum* tetep ana.46% saka aktivitase.79 Miturut Kurniawati lan Nicelle80, Enzim *Ganoderma lucidum* nuduhake stabilitas sing apik banget nganti sedheng ing suhu 25°C lan nilai pH wiwit saka 5,0 nganti 8,0, lan stabilitas ing pH 6,0 lan suhu wiwit saka 10 nganti 30°C. Ing panliten iki, kita nemokake yen pH lan suhu optimal kanggo aktivitas enzim kanggo *Pleurotus ostreatus* yaiku 3,0 lan 70°C. Sawise inkubasi ing suhu 40°C lan 50°C sajrone rong jam, enzim kasebut nahan 68,33% lan 59,61% saka aktivitase. Salajengipun, Pleurotus ostreatus NRC 620 laccase nuduhake aktivitas sing dhuwur ing kisaran suhu sing amba wiwit saka 50°C nganti 80°C, meh tekan aktivitas maksimal (69%–98%), kanthi aktivitas maksimal diamati ing 70°C.
Kesimpulane, jamur tiram laktase NRC620, sing dipikolehi ing kahanan statis, nuduhake aktivitas lan stabilitas sing optimal ing macem-macem kahanan pH lan suhu, nuduhake stabilitas sing luwih unggul dibandhingake karo sumber enzim liyane. Penambahan 10 mM MgSO₄ lan CuSO₄ nambah aktivitas enzim kira-kira 21% lan 35%. Nalika diolah dadi jus apel, enzim kasebut nyuda pH lan viskositas, dene kandungan fenolik mung mudhun sithik sajrone panyimpenan.
Asil kasebut ngonfirmasi potensi laccase ing industri panganan, utamane ing klarifikasi minuman. Kanthi khusus ngrusak senyawa fenolik, laccase ora mung nyuda kekeruhan lan nambah kejernihan nanging uga njaga kualitas jus buah ing kahanan operasi sing entheng. Ora kaya agen klarifikasi tradisional kayata gelatin, bentonit, lan gel silika, laccase ora ngasilake limbah utawa mbusak aroma sing nyenengake saka minuman, saengga dadi pilihan sing luwih ramah lingkungan lan lestari. Salajengipun, dibandhingake karo enzim lan metode filtrasi liyane, laccase nawakake solusi sing ditargetake lan efektif biaya tanpa ngorbanake kualitas produk.
Kyomuhimbo, HD lan Brink, HG. Aplikasi lan strategi imobilisasi laccase sing ngandhut tembaga; tinjauan. Heliyon 9, e13156 (2023).
Wektu kiriman: 15 Desember 2025